Vad är CRISPR?

CRISPR-tekniken är ett enkelt men ändå kraftfullt verktyg för redigering av genom. Det gör det möjligt för forskare att enkelt ändra DNA-sekvenser och ändra genfunktionen. Dess många potentiella tillämpningar inkluderar korrigering av genetiska defekter, behandling och förebyggande av spridning av sjukdomar och förbättring av grödor. Löften väcker emellertid också etiska problem.

I populär användning är "CRISPR" (uttalat "skarpare") kortfattat för "CRISPR-Cas9." CRISPR är specialiserade DNA-streck. Proteinet Cas9 (eller "CRISPR-associerat") är ett enzym som fungerar som ett par molekylsaxar, som kan skära DNA-strängar.

CRISPR-tekniken anpassades från de naturliga försvarsmekanismerna för bakterier och archaea (domänen för encelliga mikroorganismer). Dessa organismer använder CRISPR-härledd RNA och olika Cas-proteiner, inklusive Cas9, för att folieattacker av virus och andra främmande organ. De gör det främst genom att hugga upp och förstöra DNA från en utländsk inkräktare. När dessa komponenter överförs till andra, mer komplexa organismer, möjliggör hantering av gener, eller "redigering".

Fram till 2017 visste ingen verkligen hur denna process såg ut. I ett papper som publicerades 10 november 2017, i tidskriften Nature Communications, visade ett team av forskare under ledning av Mikihiro Shibata från Kanazawa University och Hiroshi Nishimasu från University of Tokyo hur det ser ut när en CRISPR är i aktion för första gången tid. [Ett hisnande nytt GIF-program CRISPR som tuggar upp DNA]

CRISPR-Cas9: De viktigaste spelarna

CRISPRs: "CRISPR "står för" kluster av regelbundet mellanliggande korta palindromiska upprepningar. "Det är ett specialiserat DNA-område med två distinkta egenskaper: närvaron av nukleotidupprepningar och distanser. Upprepade sekvenser av nukleotider - byggstenarna för DNA - är fördelade över en CRISPR Mellanrum är bitar av DNA som är isär varandra bland dessa upprepade sekvenser.

När det gäller bakterier tas avståndsdelarna från virus som tidigare angripit organismen. De fungerar som en bank av minnen, som gör det möjligt för bakterier att känna igen virusen och bekämpa framtida attacker.

Detta demonstrerades först experimentellt av Rodolphe Barrangou och ett forskarlag vid Danisco, ett livsmedelsingrediensföretag. I ett papper från 2007 publicerat i tidskriften Science använde forskarna Streptococcus thermophilus bakterier, som vanligtvis finns i yoghurt och andra mejerikulturer, som deras modell. De observerade att efter ett virusangrepp införlivades nya distanser i CRISPR-regionen. Dessutom var DNA-sekvensen för dessa distanselement identisk med delar av virusgenomet. De manipulerade också avståndsdelarna genom att ta ut dem eller sätta in nya virala DNA-sekvenser. På detta sätt kunde de förändra bakteriens resistens mot ett angrepp av ett specifikt virus. Således bekräftade forskarna att CRISPR: er spelar en roll för att reglera bakteriell immunitet.

CRISPR RNA (crRNA): När en distans har införlivats och viruset attackerar igen transkriberas och behandlas en del av CRISPR till CRISPR RNA, eller "crRNA." Nukleotidsekvensen för CRISPR fungerar som en mall för att producera en komplementär sekvens av enkelsträngat RNA. Varje crRNA består av en nukleotidupprepning och en distansdel, enligt en recension från Jennifer Doudna och Emmanuelle Charpentier från 2014, publicerad i tidskriften Science.

Cas9: Cas9-proteinet är ett enzym som skär ned främmande DNA.

Proteinet binder typiskt till två RNA-molekyler: crRNA och en annan som kallas tracrRNA (eller "transaktiverande crRNA"). De två leder sedan Cas9 till målsidan där de kommer att göra sitt snitt. Denna expans av DNA är komplementär till en 20-nukleotidsträcka av crRNA.

Med hjälp av två separata regioner, eller "domäner" på sin struktur, skär Cas9 båda strängarna av den dubbla helixen av DNA, vilket gör det som kallas en "dubbelsträngad paus", enligt vetenskapens artikel 2014.

Det finns en inbyggd säkerhetsmekanism som säkerställer att Cas9 inte bara skär någonstans i ett genom. Korta DNA-sekvenser kända som PAM ("protospacer angränsande motiv") fungerar som taggar och sitter intill måls DNA-sekvensen. Om Cas9-komplexet inte ser ett PAM bredvid sin DNA-målsekvens, kommer det inte att skäras. Detta är en möjlig orsak till att Cas9 inte någonsin attackerar CRISPR-regionen i bakterier, enligt en översyn från 2014 publicerad i Nature Biotechnology.

CRISPR-Cas9 som ett genomredigeringsverktyg

Genomen från olika organismer kodar för en serie meddelanden och instruktioner inom deras DNA-sekvenser. Genomredigering innebär att du ändrar dessa sekvenser och därmed ändrar meddelanden. Detta kan göras genom att infoga ett skär eller bryta i DNA och lura en cells naturliga DNA-reparationsmekanismer för att införa de förändringar man vill ha. CRISPR-Cas9 ger ett sätt att göra det.

2012 publicerades två viktiga forskningsartiklar i tidskrifterna Science och PNAS, som hjälpte till att förvandla bakteriell CRISPR-Cas9 till ett enkelt, programmerbart verktyg för redigering av genomer..

Studierna, genomförda av separata grupper, drog slutsatsen att Cas9 kunde riktas till att skära vilken DNA-region som helst. Detta kan göras genom att helt enkelt ändra nukleotidsekvensen för crRNA, som binder till ett komplementärt DNA-mål. I Science-artikeln 2012 förenklade Martin Jinek och kollegor systemet ytterligare genom att smälta crRNA och tracrRNA för att skapa en enda "guide RNA." Således kräver genomredigering endast två komponenter: ett vägledande RNA och Cas9-proteinet.

"Operativt utformar du en sträcka av 20 baspar som motsvarar en gen som du vill redigera", säger George Church, professor i genetik vid Harvard Medical School. En RNA-molekyl komplementär till dessa 20 baspar konstrueras. Kyrkan betonade vikten av att se till att nukleotidsekvensen endast finns i målgenen och ingen annanstans i genomet. "Då kommer RNA plus proteinet [Cas9] att skära - som en sax - DNA på den platsen, och helst ingen annanstans," förklarade han.

När DNA: n har klippts, sparkar cellens naturliga reparationsmekanismer in och arbetar för att införa mutationer eller andra förändringar i genomet. Det finns två sätt detta kan hända. Enligt Huntingtons Outreach-projekt vid Stanford (University) innebär en reparationsmetod att limma de två skärningarna igen. Denna metod, känd som "icke-homolog slutförening", tenderar att införa fel. Nukleotider infogas eller raderas av misstag, vilket resulterar i mutationer, vilket kan störa en gen. I den andra metoden fixeras brottet genom att fylla i gapet med en sekvens av nukleotider. För att göra det använder cellen en kort DNA-sträng som mall. Forskare kan tillhandahålla den DNA-mall som de väljer och därmed skriva in den gen som de vill eller korrigera en mutation.

Verktyg och begränsningar

CRISPR-Cas9 har blivit populärt de senaste åren. Kyrkan konstaterar att tekniken är enkel att använda och är ungefär fyra gånger effektivare än det tidigare bästa genomredigeringsverktyget (kallad TALENS).

2013 publicerades de första rapporterna om att använda CRISPR-Cas9 för att redigera mänskliga celler i en experimentell miljö av forskare från laboratorierna i Church och Feng Zhang från Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology och Harvard. Studier med in vitro (laboratorium) och djurmodeller av mänsklig sjukdom har visat att tekniken kan vara effektiv för att korrigera genetiska defekter. Exempel på sådana sjukdomar inkluderar cystisk fibros, grå starr och Fanconi-anemi, enligt en översiktsartikel 2016 publicerad i tidskriften Nature Biotechnology. Dessa studier banar väg för terapeutiska tillämpningar hos människor.

"Jag tror att den offentliga uppfattningen av CRISPR är mycket fokuserad på idén att använda genredigering kliniskt för att bota sjukdomar," sa Neville Sanjana från New York Genome Center och biträdande professor i biologi, neurovetenskap och fysiologi vid New York University. "Detta är utan tvekan en spännande möjlighet, men det här är bara en liten bit."

CRISPR-teknik har också använts inom livsmedels- och jordbruksindustrin för att konstruera probiotiska kulturer och för att vaccinera industrikulturer (till exempel yoghurt) mot virus. Det används också i grödor för att förbättra avkastningen, torktoleransen och näringsegenskaperna.

En annan potentiell tillämpning är att skapa genenheter. Det här är genetiska system som ökar chansen att en viss egenskap övergår från förälder till avkomma. Så småningom, under generationerna, sprids egenskaperna genom hela befolkningar, enligt Wyss Institute. Genenheter kan hjälpa till att kontrollera spridningen av sjukdomar som malaria genom att öka steriliteten bland sjukdomsvektorn - kvinnlig Anopheles gambiae myggor - enligt artikeln Naturbioteknologi 2016. Dessutom kan genenheter också användas för att utrota invasiva arter och motverka resistens mot bekämpningsmedel och herbicid, enligt en artikel från Kenneth Oye och kollegor från 2014, publicerad i tidskriften Science.

CRISPR-Cas9 är dock inte utan sina nackdelar.

"Jag tror att den största begränsningen av CRISPR är att den inte är hundra procent effektiv," berättade Church. Dessutom kan effektiviteten i genomredigeringen variera. Enligt artikel Science från Doudna och Charpentier 2014, inträffade genredigering i nästan 50 procent av cellerna som fick Cas9-RNA-komplexet i en studie genomförd i ris. Medan andra analyser har visat att beroende på målet kan redigeringseffektiviteten nå upp till 80 procent eller mer.

Det finns också fenomenet "effekter utanför målet", där DNA skärs på andra platser än det avsedda målet. Detta kan leda till införandet av oavsiktliga mutationer. Dessutom noterade kyrkan att även när systemet minskar målen finns det en chans att inte få en exakt redigering. Han kallade detta "genomvandalism."

Ställa in gränser

De många potentiella tillämpningarna av CRISPR-tekniken väcker frågor om de etiska fördelarna och konsekvenserna av att manipulera med genom.

I Science-artikeln 2014 pekar Oye och kollegor på de potentiella ekologiska effekterna av att använda genenheter. En introducerad egenskap kunde spridas utöver målpopulationen till andra organismer genom korsavel. Genenheter kan också minska målpopulationens genetiska mångfald.

Att göra genetiska modifieringar av mänskliga embryon och reproduktionsceller som spermier och ägg är känd som gränsredigering. Eftersom förändringar av dessa celler kan vidarebefordras till efterföljande generationer har användning av CRISPR-teknik för att göra gränsöverskridande väckt ett antal etiska problem.

Variabel effekt, effekter utanför målet och opräknade ändringar utgör alla säkerhetsrisker. Dessutom är det mycket som fortfarande är okänt för den vetenskapliga gemenskapen. I en artikel från 2015 publicerad i Science konstaterar David Baltimore och en grupp forskare, etiker och juridiska experter att gränsledning ger möjligheten till oavsiktliga konsekvenser för kommande generationer "eftersom det finns gränser för vår kunskap om mänsklig genetik, gen-miljöinteraktioner, och sjukdomsvägarna (inklusive samspelet mellan en sjukdom och andra tillstånd eller sjukdomar hos samma patient). "

Andra etiska problem är mer nyanserade. Bör vi göra förändringar som i grunden kan påverka kommande generationer utan att ha fått sitt samtycke? Vad händer om användningen av kimlinjeredigeringen skiljer sig från att vara ett terapeutiskt verktyg till ett förbättringsverktyg för olika människors egenskaper?

För att hantera dessa problem samlade National Academies of Sciences, Engineering and Medicine en omfattande rapport med riktlinjer och rekommendationer för genomredigering.

Även om de nationella akademierna uppmanar till försiktighet i att fortsätta gränslinjeredning, betonar de "försiktighet betyder inte förbud." De rekommenderar att groddredigeringen endast görs på gener som leder till allvarliga sjukdomar och endast när det inte finns några andra rimliga behandlingsalternativ. Bland andra kriterier betonar de behovet av att ha uppgifter om hälsorisker och fördelar och behovet av kontinuerligt tillsyn under kliniska prövningar. De rekommenderar också att följa upp familjer i flera generationer.

Nyligen genomförd forskning

Det har varit många nyligen genomförda forskningsprojekt kring CRISPR. "Takten på grundläggande forskningsupptäckter har exploderat, tack vare CRISPR," säger biokemisten och CRISPR-experten Sam Sternberg, gruppledaren för teknisk utveckling vid Berkeley, Kalifornien-baserade Caribou Biosciences Inc., som utvecklar CRISPR-baserade lösningar för medicin, jordbruk och biologisk forskning.

Här är några av de senaste resultaten:

• I april 2017 släppte ett forskargrupp forskning i tidskriften Science att de hade programmerat en CRISPR-molekyl för att hitta virusstammar, som Zika, i blodserum, urin och saliv.
• Den 2 augusti 2017 avslöjade forskare i tidskriften Nature att de hade tagit bort en hjärtsjukdomdefekt i ett embryo med framgång med CRISPR.
• Den 2 januari 2018 meddelade forskare att de kanske kan stoppa svampar och andra problem som hotar chokladproduktion med CRISPR för att göra växterna mer resistenta mot sjukdomar.
• Den 16 april 2018 uppgraderade forskare CRISPR för att redigera tusentals gener på en gång, enligt forskning publicerad av tidskriften BioNews.

Ytterligare rapportering av Alina Bradford, bidragsgivare.

Ytterligare resurser

• Bredt institut: En tidslinje för det centrala arbetet med CRISPR
• Nyheter om genteknik & bioteknik: CRISPR-Cas9 förbättrad 10000-faldigt av syntetiska nukleotider
• Bredt institut: Frågor och svar om CRISPR